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Jun 10, 2023

Auswirkungen der Zugabe von exogener Protease auf die Fermentation und den Nährwert von rehydrierten Mais- und Sorghumkorn-Silagen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7302 (2023) Diesen Artikel zitieren 380 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Das Ziel der Studie war die Bewertung der Auswirkungen der Zugabe von exogenen Stoffen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7302 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Ziel der Studie bestand darin, die Auswirkungen der Zugabe von exogener Protease auf die Fermentation und den Nährwert von rehydrierten Mais- und Sorghumkornsilagen während verschiedener Lagerzeiträume zu bewerten. Die Behandlungen wurden unter Verwendung einer 2 × 6 × 3-Faktorkombination mit 2 Arten rehydrierter Körner (Mais und Sorghum) und 6 Dosen des Enzyms (0, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2 und 1,5 %, bezogen auf die natürliche Substanz) durchgeführt. und 3 Fermentationsperioden (0, 60 und 90 Tage) in einem vollständig randomisierten Design mit 4 Wiederholungen. Es wurde die Protease Aspergilopepsin I aus Pilzen verwendet, die von Aspergillus niger produziert wird. Die Milchsäurekonzentration stieg linear mit steigender Enzymdosis in Getreidesilagen aus Mais (CG) und Sorghum (SG) am 60. und 90. Tag der Fermentation an. Im Vergleich zur Behandlung ohne Zusatz von Protease kam es in rehydrierten CG- und SG-Silagen zu einem Anstieg der Konzentrationen an Ammoniakstickstoff und löslichem Protein sowie der In-situ-Stärkeverdaulichkeit. Die Zugabe von 0,3 % exogener Protease zum Zeitpunkt der CG-Silierung und von 0,5 % rehydratisiertem SG erhöhte die proteolytische Aktivität während der Fermentation und sorgte für eine Erhöhung der In-situ-Stärkeverdaulichkeit in kürzerer Lagerzeit.

Rehydrierte Getreidesilage ist das Produkt, das aus der anaeroben Fermentation reifer, gemahlener Körner mit rekonstituierter Feuchtigkeit entsteht, wobei Mikroorganismen wasserlösliche Kohlenhydrate verbrauchen und kurzkettige organische Säuren produzieren. Es handelt sich um eine langjährige Technologie1, die in den letzten Jahren2,3,4,5,6 wiederbelebt wurde. In einer in Brasilien durchgeführten Studie erwähnten Bernardes et al.7, dass 52,4 % der Milchbauern Körnersilage (Mais oder Sorghum) in der Tierernährung einsetzten, 16,6 % entsprachen rehydrierter Maiskörnersilage.

Der Einsatz dieser Technologie erfreute sich vor allem aufgrund der häufig beobachteten Hindernisse bei Maiskörnersilage mit hohem Feuchtigkeitsgehalt großer Beliebtheit, beispielsweise das enge Fenster für die Ernte feuchter Körner. Es ermöglicht auch strategische Einkäufe in Zeiten niedriger Maispreise. Darüber hinaus kann die Lagerung von rehydriertem Getreide als Silage die Entwicklung von Pilzen verhindern oder reduzieren und somit eine Kontamination durch Mykotoxine in den gelagerten Materialien vermeiden. Darüber hinaus können positive Veränderungen im Nährwert des produzierten Futters erzielt werden2,8,9 .

Während des Fermentationsprozesses fördern mikrobielle Proteasen sowie von Milchsäurebakterien produzierte organische Säuren die Solubilisierung der Proteinmatrix, die die Stärkekörnchen umgibt, und erhöhen so die Verdaulichkeit durch Pansenmikroorganismen3,10. Rehydrierte Getreidesilage erfordert jedoch längere Lagerzeiten, um die Verdaulichkeit der Trockenmasse stärker zu steigern5,11. Carvalho et al.11 berichteten über einen Anstieg der In-vitro-Trockenmasseverdaulichkeit von rehydrierter Maiskörnersilage nach 280 Tagen Lagerung im Vergleich zu 30, 60, 90 und 150 Tagen Lagerung. Eine erhöhte In-situ-Stärkeverdaulichkeit von rehydratisierter Maiskörnersilage wurde von Fernandes et al.12 nach 120 Tagen Fermentation im Vergleich zu Mais beim Silieren beobachtet, mit Werten von 92,0 bzw. 72,0 %. Bei der Silage von rehydriertem Sorghumkorn beobachteten Santos et al.13, dass Kühe, die mit Futter gefüttert wurden, das 30 Tage lang gelagerte Silagen enthielt, eine geringere Stärkeverdaulichkeit aufwiesen (86,9 %) im Vergleich zu Kühen, die mit Futter gefüttert wurden, dessen Silage 90 Tage lang gelagert wurde (89,3 %).

Exogene Proteasen sind vielversprechende Zusatzstoffe, die eine Nährstoffverbesserung in Maispflanzensilage14, Maiskörnern mit hohem Feuchtigkeitsgehalt15 und rehydrierten Maiskörnern16 in kürzeren Lagerzeiten fördern, die je nach Silagetyp und verwendeter Enzymdosis zwischen 30 und 70 Tagen lagen. Proteasen sind Enzyme, die Peptidketten unter geeigneten pH- und Temperaturbedingungen hydrolysieren, was während der Fermentation zu einem Anstieg der Konzentrationen von Ammoniak und löslichem Protein in Silagen führt, was eine positive Korrelation mit der Stärkeverdaulichkeit darstellt, wie von Ferrareto et al.17 und Kung berichtet et al.15.

Bisher gibt es in der Literatur keine Berichte über die Verwendung exogener Proteasen in der Silage von rehydrierten Sorghumkörnern und in Brasilien bei rehydrierten Maiskörnern. Die Hypothese unserer Studie ist, dass die Zugabe von exogener Protease zur Silage von rehydrierten Mais- und Sorghumkörnern die Solubilisierung der Proteinfraktion begünstigt und die Stärkeverdaulichkeit der Silagen in einer kürzeren Lagerzeit verbessert. Ziel war es daher, die Auswirkungen der Zugabe von exogener Protease auf die Fermentation und den Nährwert von rehydrierten Mais- und Sorghumkornsilagen in verschiedenen Lagerperioden zu bewerten.

Das Experiment wurde am Institut für Tierwissenschaften der Bundesuniversität Viçosa (Bundesuniversität Viçosa – UFV, Viçosa, MG, Brasilien) durchgeführt. Viçosa liegt auf 20°45′ südlicher Breite, 42°51′ westlicher Länge und 657 m über dem Meeresspiegel, mit einer durchschnittlichen jährlichen Niederschlagsmenge von 1,341 mm.

Fünfzig Kilogramm Maiskörner (CG) und Sorghumhirse (SG) wurden an der Bundesuniversität Viçosa (UFV) gewonnen und in einer Hammermühle (DMP-2, Nogueiras, São João da Boa Vista, São Paulo, Brasilien) gemahlen ein 3-mm-Sieb. Anschließend wurde die Getreidefeuchtigkeit mit Hilfe eines Futtermischers zur Homogenisierung wieder auf 35 % gebracht. Die rehydrierten Mais- und Sorghumkörner wurden auf 48 Haufen (24 CG-Haufen und 24 SG-Haufen) verteilt, wobei jeder Haufen 2,5 kg rehydrierte Körner enthielt.

Die aktuelle Studie entspricht den brasilianischen ethischen Vorschriften. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften für Pflanzen durchgeführt.

Das kommerzielle Produkt FoodPro PAL (PD 263063-3.0EN, DANISCO), eine Quelle exogener Protease, hat eine Zusammensetzung aus (w/w) 50 % Glycerin, 32–40 % Wasser, 10–12 % Aspergilopepsin I und 0– 2,8 % Natriumsulfat. Aspergilopepsin ist eine Protease pilzlichen Ursprungs, die von Aspergillus niger produziert wird und eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 2,5 bis 3,0 und einer Temperatur von 55 bis 60 °C aufweist, wie vom Hersteller angegeben. Die Mengen des kommerziellen Produkts, die sich auf die in der Studie bewerteten Dosen beziehen, wurden in 50 ml destilliertem Wasser verdünnt und nach dem Zufallsprinzip auf die Pfähle aufgetragen. Die gleiche Menge Wasser wurde auf die Kontrollbehandlung gesprüht (0 % Enzymzugabe). Das Material wurde homogenisiert und 1 kg Mais- und Sorghumkorn in Nylon-Polyethylen-Beutel (25 × 35 cm; Doug Care Equipment Inc., Springville, CA) gepackt und die Luft mit einem Vakuumierer aus den Beuteln evakuiert ( Öko-Staubsauger 1040, Orved, Italien). In jedem Stapel wurden zwei Beutel vorbereitet, die sich auf 60 und 90 Tage Gärung beziehen. Die Beutel wurden im Labor bei Raumtemperatur gelagert. Das verbleibende Material (500 g) aus Periode Null wurde zur weiteren Analyse in Polyethylenbeuteln aufbewahrt. Vor dem Silieren wurden Proben getrockneter und rehydratisierter Körner zur Materialcharakterisierung gesammelt (siehe Ergänzungstabelle S1).

Es wurde ein 2 × 6 × 3-Faktorschema mit 2 Körnern (Mais und Sorghum), 6 Dosen des Enzyms (0, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2 und 1,5 % basierend auf NM) und 3 Fermentationsperioden (0, 60 und 90 Tage) in einem vollständig randomisierten Design mit 4 Wiederholungen.

Wasserextrakte aus den Silage- oder Getreideproben (Tag 0) wurden durch Homogenisieren von 25 g Probe in 225 ml steriler Lösung (Ringer Solution, Oxoid, Hampshire) in einem Industriemixer für 1 Minute hergestellt. Anschließend wurde der Extrakt durch eine doppelte Schicht steriler Gaze filtriert und der pH-Wert mit Hilfe eines Potentiometers (Tecnal, SP, Brasilien) gemessen.

Ein 15-ml-Aliquot des Extrakts wurde durch Whatman 54-Filterpapier (Whatman, Florham, NJ) filtriert und zur weiteren Analyse von Ammoniakstickstoff (NH3-N)18 und wasserlöslichen Kohlenhydraten ( WSC)19, Milchsäure (LA), Essigsäure (AA), Buttersäure (BA) und Ethanol (ETA) durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA)20.

Die Populationen von Milchsäurebakterien (LAB), Enterobakterien (ENT), Schimmelpilzen und Hefen in den Körnern vor dem Silieren (Tag 0) und in den jeweiligen Silagen wurden quantifiziert. Ein Aliquot (10 ml) des Wasserextrakts (25 g Getreide/225 ml sterile Kochsalzlösung) wurde einer Reihenverdünnung (10–1 bis 10–8) unterzogen. Mikroorganismen wurden in sterilen Petrischalen auf De Man, Rogosa und Sharpe Ágar von LAB kultiviert; Violettrote HNO-Galle und Kartoffel-Dextrose-Agar, ergänzt mit 1,5 % 10 % Weinsäure (Gew./Vol.), für Schimmelpilze und Hefen, unter Verwendung der Gussplatten-Plattiertechnik. Die Platten wurden in einem Ofen inkubiert, wobei Temperatur und Zeitraum für jede Gruppe von Mikroorganismen wie folgt bestimmt wurden: ENT, 37 °C/24 h; LABOR, 37 °C/48 h; Hefe und Schimmel, 25 °C/72 bzw. 120 h. Es wurden Platten mit zwischen 30 und 300 koloniebildenden Einheiten gezählt (KBE).

Getreideproben vor dem Silieren und Silieren wurden 72 Stunden lang in einem Umluftofen bei 55 °C getrocknet und dann in einer Willey-Mühle mit einem 1-mm-Sieb gemahlen. Die Gehalte an DM (934.01-Methode) und Rohprotein, CP (984.13-Methode) wurden gemäß AOAC21, neutrale Waschmittelfasern (NDF) gemäß Mertens22, Stärke gemäß Hall23 und das nach der Behandlung erhaltene gesamte lösliche Protein (P-Sol) analysiert Proben mit Boratphosphatpuffer (BPB), wobei die P-Sol-Werte den Fraktionen A und B1 entsprachen, erhalten aus der Differenz zwischen Gesamtstickstoff und unlöslichem Stickstoff in BPB gemäß Licitra et al.24.

Für den In-situ-Test zur Pansenstärkeverdaulichkeit (ISSD) wurde eine etwa 5,0 g schwere Probe (3 mm Partikelgröße) aus jeder Behandlung einzeln in Nylonbeutel (Sefar Nitex, Schweiz; Porosität 50 μm, 400 cm2 Oberfläche) eingewogen und darin inkubiert 4 Nellore-Rinder mit einem Durchschnittsgewicht von 300 ± 18 kg, versehen mit einer Kanüle im Pansen. Nach 7 Stunden Inkubation wurden die Beutel aus dem Pansen genommen und unter fließendem Wasser gewaschen, bis das Wasser klar war. Anschließend wurden sie 72 Stunden lang in einem belüfteten Ofen bei 55 °C und anschließend 2 Stunden lang in einem Ofen bei 105 °C aufbewahrt und anschließend gewogen. Der Rückstand aus jedem Nylonbeutel wurde entfernt und in einer Messermühle (Tecnal, Piracicaba, São Paulo, Brasilien) mit einem 1-mm-Sieb gemahlen und zur weiteren Analyse der Reststärke gemäß Hall23 in Polyethylenbeutel gegeben.

Fünfzehn Tage vor der Inkubation erhielten die Versuchstiere eine Trockennahrung mit 50 % Maissilage und 50 % Kraftfutter.

Die experimentellen Verfahren wurden durch die Regeln der Ethikkommission für die Verwendung von Nutztieren der UFV (CEUAP/UFV, Protokoll Nr. 037/2018) genehmigt. Die Methoden entsprachen auch den ARRIVE-Richtlinien (Animal Research Reporting In Vivo Experiments) für die Berichterstattung über Tierversuche.

Die Daten zu organischen Säuren und Ethanol wurden in einem 2 × 6 × 2-Faktorschema analysiert, bei dem die Fermentationsperiode 0 (Null) nicht berücksichtigt wurde; Die anderen Variablen wurden in einem 2 × 6 × 3-Fakultätsschema in einem vollständig randomisierten Design analysiert. Die Getreidesorte (G), die Enzymdosen (E) und die Fermentationszeiten (P) sowie die Wechselwirkungen zwischen Faktoren galten dem Modell zufolge als feste Effekte:

wobei Yijk = Antwortvariable; µ = allgemeine Konstante; Gi = Korneffekt i; Ej = Enzymwirkung j; (GE)ij = Wechselwirkung von Korn i und Enzym j; (GP)ik = Wechselwirkung von Korn i und Periode k; (EP)jk = Interaktion von Enzym j und Periode k; (GEP)ijk = Wechselwirkung von Korn i, Enzym j und Periode k; und eijkl = Zufallsfehler unter Annahme einer unabhängigen Normalverteilung, NID (0,σ2). Nach der Varianzanalyse wurden die signifikanten Wechselwirkungen bestimmt und die Mittelwerte mithilfe des Tukey-Tests verglichen. Der Enzymfaktor wurde mittels Regressionsanalyse analysiert und die Gleichungen wurden basierend auf ihren Bestimmtheitskoeffizienten (R2) und der Signifikanz der Regressionskoeffizienten ausgewählt. Die angenommene kritische Wahrscheinlichkeitsstufe für einen Typ-I-Fehler betrug 0,05, durch den PROC MIXED von SAS Version 9.425. Für die Variablen P-sol, NH3-N, ISSD und NDF wurden die durch Modell (1) geschätzten Mittelwerte an ein quadratisches Polynommodell mit einer Plateau-Antwort unter Verwendung des PROC NLIN-Verfahrens von SAS Version 9.4 angepasst, gemäß den Gleichungen:

wobei Y = variabler Gehalt als Funktion der Enzymdosis x; p = Plateau; a, b und c = geschätzte Modellparameter. Für x-Werte kleiner als x0 ist das Modell, das die Antwort Y beschreibt, eine quadratische Funktion, und für x-Werte größer oder gleich x0 ist die Gleichung eine Konstante oder ein Plateau.

Es gab einen Effekt (P < 0,01) der G × E × P-Wechselwirkung auf LA, NH3-N und Hefen. Die Variablen pH, ETA und LAB wurden durch die Wechselwirkung G × E, G × P und E × P beeinflusst (P < 0,05), während AA nur durch E beeinflusst wurde (P = 0,02) (Tabelle 1).

Es gab einen linearen Anstieg der LA-Konzentrationen (P < 0,01) mit einem Anstieg der Enzymdosen in CG- und SG-Silagen, wobei Werte von 32,03 und 32,25 g/kg TS nach 60 Tagen und 31,36 und 32,0,60 g/kg TS nach 90 Tagen registriert wurden der Gärung bei einer Dosierung von jeweils 1,5 % (Abb. 1). Die in den Silagen beobachtete AA-Konzentration wurde an ein quadratisches Modell (P = 0,008) angepasst (Abb. 1).

Regressionsanalyse für Milchsäurekonzentrationen, die durch die G × E × P-Wechselwirkung (a, P = 0,0008, SEM = 0,705) und den Enzymeffekt für Essigsäurekonzentrationen (b, P = 0,019, SEM = 0,271) in rehydrierter Mais- und Sorghumkornsilage beeinflusst werden , behandelt oder nicht, mit Enzym in verschiedenen Fermentationsperioden. CG = Maiskorn; GS = Sorghumkorn; P = Zeitraum (60 und 90 Tage).

CG- und SG-Silagen zeigten ähnliche ETA-Konzentrationen, außer bei Dosen von 1,2 % (P = 0,02) und 1,5 % (P = 0,008) Enzym, bei denen SG-Silagen höhere Konzentrationen als CG aufwiesen (siehe ergänzende Abbildung S1). Das Vorhandensein von BA wurde in den in der vorliegenden Studie untersuchten Silagen nicht nachgewiesen, und es wurden keine Populationen von Enterobakterien oder Schimmelpilzen in den Silagen beobachtet.

Zum Zeitpunkt der Silierung hatte die SG eine höhere (P < 0,01) LAB-Population, aber nach 60 (P = 0,34) und 90 (P = 0,67) Tagen Fermentation gab es keinen Unterschied im Vergleich zu CG-Silagen. In beiden Silagen wurden die höchsten (P < 0,01) LAB-Populationen nach 60 Tagen der Fermentation aufgezeichnet, verglichen mit den Zeiträumen 0 (null) und 90 Tagen (siehe ergänzende Abbildung S2). SG-Silagen zeigten nach 60 und 90 Tagen der Fermentation höhere Hefepopulationen (P <0,05) als CG-Silagen, mit Ausnahme von Silagen mit 0 und 1,2 % Enzymdosen (siehe ergänzende Abbildung S2).

Die für die NH3-N-Konzentration in CG- und SG-Silagen beobachteten Daten (Abb. 2) wurden an ein quadratisches Polynommodell mit Plateau-Antwort angepasst. Erhöhungen der NH3-N-Konzentrationen wurden bis zu Dosen von 0,75 % (P < 0,001) und 0,50 % (P = 0,006) Enzym in CG-Silagen und 0,80 (P = 0,002) und 0,59 % (P = 0,004) in SG-Silagen beobachtet 60 bzw. 90 Tage Gärung mit anschließender Stabilisierung der NH3-N-Konzentrationen in den Silagen (Abb. 2). Es kam zu einem etwa 8,88- bzw. 11,05-fachen Anstieg der NH3-N-Konzentrationen in CG-Silage; und 19,43- bzw. 25,14-fache Steigerung der SG-Silage nach 60 bzw. 90 Tagen der Fermentation (Abb. 2).

Konzentrationen von Ammoniakstickstoff in Mais- (a) und Sorghum- (b) Getreidesilagen, rehydriert, behandelt oder nicht, mit Enzym in verschiedenen Fermentationsperioden. Maiskorn (a) P0: Y = 0,428 − 0,55x + 1,02x2, se x < 0,27 e Y = 0,36, se x ≥ 0,27, R2 = 0,64, P60: Y = 3,84 + 15,86x − 10,63x2, se x < 0,75 e Y = 9,75, sex ≥ 0,75, R2 = 0,99, P90: Y = 4,75 + 22,52x − 21,57x2, sex < 0,52 e Y = 10,62, sex ≥ 0,52, R2 = 0,96. Sorghumkorn (b) P0: Y = 0,13 + 0,24x − 0,17x2, se x < 0,70 e Y = 0,21, se x ≥ 0,70, R2 = 0,41, P60: Y = 2,84 + 16,10x − 10,03x2, se x < 0,80 e Y = 9,30, sex ≥ 0,80, R 2 = 0,98, P90: Y = 3,52 + 25,38x − 21,47x2, sex < 0,59 e Y = 11,02, sex ≥ 0,59, R2 = 0,97.

Die Interaktion G × E × P wirkte sich auf alle Variablen des Nährwerts der Silagen aus, mit Ausnahme von DM, das durch die Interaktionen G × P (P = 0,01) und E × P (P < 0,01) beeinflusst wurde. , während CP durch die Faktoren G und P beeinflusst wurde (Tabelle 2).

Die für CG zum Zeitpunkt des Silierens (P0) und in der Silage nach 60 Tagen der Fermentation beobachteten WSC-Konzentrationen waren bei allen Enzymdosen höher (P <0, 01) als die für SG beobachteten (siehe ergänzende Abbildung S3). Ein ähnliches Ergebnis wurde für Stärkekonzentrationen beobachtet, bei denen CG zum Zeitpunkt der Silierung höhere Werte (P < 0,05) als SG aufwies. Nach 60 und 90 Tagen der Fermentation waren die Stärkekonzentrationen in CG-Silagen ebenfalls höher, außer bei Dosen von 0 % (null), 0,6 % und 1,5 % Enzym (siehe ergänzende Abbildung S3).

Die CP-Variable wurde durch die Faktoren G (P < 0,01) und P (P < 0,01) beeinflusst (Tabelle 2). SG-Silagen zeigten mit Werten von 100,9 bzw. 86,1 g/kg TS höhere Werte (P < 0,01) als CG-Silagen. Am 60. und 90. Tag der Fermentation wurde für diese Variable im Vergleich zum Zeitraum 0 (Null) ein niedrigerer Wert (P < 0,01) beobachtet, mit Werten von 90,1, 90,2 bzw. 100,1. Obwohl die Behandlung mit exogener Protease die CP-Konzentration von rehydrierten CG- und SG-Silagen nicht beeinflusste (P = 0,35), wurde P-Sol durch die G × E × P-Wechselwirkung (Tabelle 2) beeinflusst (P < 0,01), deren Daten angepasst wurden ein quadratisches Polynommodell mit einer Plateaureaktion, mit Ausnahme von Sorghumkorn in der Nullperiode (SGP0), das linear mit der Enzymdosis anstieg (Abb. 3). Erhöhungen der P-Sol-Konzentrationen wurden bis zu Dosen von 0,45 % und 0,37 % Enzym in CG-Silagen mit Plateau-Reaktionen von 88,29 % und 93,94 % CP und 0,50 und 0,53 % in SG-Silagen mit Plateau-Reaktionen von 83,83 % beobachtet 87,81 % CP nach 60 bzw. 90 Tagen der Fermentation (Abb. 3).

Konzentrationen von löslichem Protein (P-Sol) in Boratphosphatpuffer (BPB) aus rehydrierten, unbehandelten und mit Enzymen behandelten Getreidesilagen aus Mais (a) und Sorghum (b) in verschiedenen Fermentationsperioden. Maiskörner (a) P0: Y = 25,22 + 13,04x − 3,96x2, wenn x < 1,65 und Y = 35,96, wenn x ≥ 1,65, R2 = 0,97, P60: Y = 40,83 + 209,39x − 230,95x2, wenn x < 0,45 und Y = 88,29, wenn x ≥ 0,45, R2 = 0,99, P90: Y = 52,99 + 222,32x − 301,75x2, wenn x < 0,37 und Y = 93,94, wenn x ≥ 0,37, R2 = 0,99. Sorghumkorn (b) P0: Y = 6,3915x + 15,36, R2 = 0,80, P60: Y = 33,25 + 204,48x − 202,67x2, wenn x < 0,50 und Y = 83,83, wenn x ≥ 0,50, R2 = 0,99, P90: Y = 38,29 + 187,27x − 177,04x2, wenn x < 0,53 und Y = 87,81, wenn x ≥ 0,53, R2 = 0,99.

Es wurde ein Effekt (P < 0,01) der G × E × P-Wechselwirkung auf NDF beobachtet (Tabelle 2). Die NDF-Daten wurden an quadratische Polynommodelle mit Plateau-Antwort angepasst. Es wurde beobachtet, dass SG-Silage im Vergleich zu CG-Silage nach 60 und 90 Tagen der Fermentation geringere Enzymdosen erforderte, um eine Plateau-Reaktion zu erreichen (Abb. 4).

Neutraldetergensfaserkonzentrationen (NDF) von Getreidesilagen aus Mais (a) und Sorghum (b), rehydriert, unbehandelt und mit exogener Protease behandelt, in verschiedenen Fermentationsperioden. Maiskörner (a) P0: Y = 163,97 − 61,82x + 27,71x2, wenn x < 1,12 und Y = 129,49, wenn x ≥ 1,12, R2 = 0,88, P60: Y = 94,89 − 39,24x + 32,35x2, wenn x < 0,61 und Y = 82,99, wenn x ≥ 0,61, R2 = 0,89, P90: Y = 81,81 − 7,44x + 2,77x2, wenn x < 1,34 und Y = 76,81, wenn x ≥ 1,34, R2 = 0,27. Sorghumkörner (b) P0: Y = 156,33 − 39,76x + 13,39x2, wenn x < 1,48 und Y = 126,82, wenn x ≥ 1,48, R2 = 0,90, P60: Y = 114,95 − 155,69x + 176,19x2, wenn x < 0,44 und Y = 80,56, wenn x ≥ 0,44, R2 = 0,99, P90: Y = 85,86 − 61,79x + 54,86x2, wenn x < 0,56 und Y = 68,47, wenn x ≥ 0,56, R2 = 0,93.

Für die ISSD-Variable gab es eine G × E × P-Wechselwirkung (P < 0,01) (Tabelle 2), und die Daten wurden an ein quadratisches Polynommodell mit einer Plateau-Reaktion bei Dosen von 0,29 % und 0,30 % Enzym in CG-Silagen angepasst und 0,50 % bzw. 0,44 % bei SG-Silagen, was zu einer Steigerung der Stärkeverdaulichkeit von etwa 44,9 % (648,39 gegenüber 939,62 g/kg Stärke) und 43 % (676,81 gegenüber 967,42 g/kg Stärke) bei CG-Silagen und 69,6 (346,53) führte gegenüber 587,88 g/kg Stärke) und 66,7 % (376,99 gegenüber 628,57 g/kg Stärke) in SG-Silagen, nach 60 bzw. 90 Tagen der Fermentation (Abb. 5). Trotz des größeren Anstiegs bei SG-Silagen wiesen CG-Silagen numerisch höhere ISSD-Werte auf (Abb. 5). Unabhängig von der Fermentationsdauer lieferte die Enzymdosis von 0,30 % basierend auf dem quadratischen Modell einer Plateau-Reaktion eine maximale Stärkeverdaulichkeit in CG-Silage, während die Stärkeverdaulichkeit bei SG-Silage einen Maximalwert bei Dosen von 0,50 % und 0,44 % erreichte. bei einer Lagerung von 60 bzw. 90 Tagen (Abb. 5).

In-situ-Stärkeverdaulichkeit (ISSD) von rehydrierten, unbehandelten und enzymatischen Getreidesilagen aus Mais (a) und Sorghum (b) in verschiedenen Fermentationsperioden. Maiskörner (a) P0: Y = 418,53 + 371,14x − 488,7x2, wenn x < 0,38 und Y = 489,001, wenn x ≥ 0,38, R2 = 0,83, P60: Y = 648,39 + 2003,25x − 3444,9x2, wenn x < 0,29 und Y = 939,62, wenn x ≥ 0,290, R2 = 0,99, P90: Y = 676,81 + 1767,55x − 2687,7x2, wenn x < 0,30 und Y = 967,424, wenn x ≥ 0,328, R2 = 0,99. Sorghumkörner (b) P0: Y = 312,05 − 40,67x + 16,80x2, wenn x < 1,21 und Y = 287,43, wenn x ≥ 1,21, R2 = 0,14, P60: Y = 346,53 + 994,91x − 1025,4x2, wenn x < 0,49 und Y = 587,88, wenn x ≥ 0,49, R2 = 0,97, P90: Y = 376,99 + 1150,81x − 1316,1x2, wenn x < 0,44 und Y = 628,57, wenn x ≥ 0,44, R2 = 0,97.

Die anfängliche Konzentration von WSC hat einen wichtigen Einfluss auf die Geschwindigkeit des pH-Abfalls während der Silierung, da es sich um das Substrat handelt, das für den LAB-Metabolismus verwendet wird. Die niedrigen WSC-Konzentrationen der Körner vor dem Silieren (siehe Ergänzungstabelle S1) schränkten weder das Wachstum von LAB (siehe Ergänzungsabbildung S2) noch den Fermentationsprozess ein, da die in den Silagen an den Tagen 60 und 90 der Fermentation beobachteten pH-Werte der zwischen 3,93 und 4,02 variierte, konnte für die bewerteten Silagen als ausreichend angesehen werden (siehe ergänzende Abbildung S4). Der pH-Wert wird direkt von der Konzentration der von LAB produzierten organischen Säuren beeinflusst, wobei LA als das wirksamste Mittel zur Senkung des pH-Werts während der Fermentation gilt26. Der lineare Anstieg der LA-Konzentrationen in unserer Studie (Abb. 1) war wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Zugabe von exogener Protease die Proteolyse steigerte und folglich zu einer stärkeren Freisetzung von Peptiden und freien Aminosäuren führte, die das Wachstum von Milchsäure begünstigen säureproduzierende Bakterien16,27,28.

Der geschätzte Mindestwert für Essigsäure von 0,79 g/kg TS bei einer Dosis von 0,9 % des Enzyms (Abb. 1) kann auf der Grundlage der angegebenen empfohlenen Konzentrationen für diese Säure in Maisgetreidesilage mit hohem Feuchtigkeitsgehalt als angemessen angesehen werden von Kung et al.26. Ein Anstieg der AA-Konzentration wurde von Young et al.28 in Maissilage berichtet, die 150 Tage nach der Fermentation mit exogener Protease behandelt wurde. Allerdings fanden Kung et al.15 und Ferrareto et al.16 keinen Einfluss auf die Zugabe von Protease in Maiskörnersilage mit hoher Feuchtigkeit bzw. rehydrierter Maiskörnersilage.

In der vorliegenden Studie wiesen beide Silagen unabhängig von der Dosis und der Fermentationsdauer ETA-Konzentrationen im Bereich (2–20 g/kg TS) auf, der von Kung et al.26 für Maiskörnersilagen mit hohem Feuchtigkeitsgehalt vorgeschlagen wurde. Hefen sind die Hauptmikroorganismen, die während der Fermentation für die Produktion von Ethanol verantwortlich sind (siehe ergänzende Abbildungen S1 und S2).

Dass nach 60 und 90 Tagen der Fermentation keine Enterobakterien nachgewiesen wurden, war wahrscheinlich auf den pH-Wert der silierten Masse zurückzuführen, da diese Mikrobengruppe empfindlich auf niedrige pH-Werte reagiert, wie von Pahlow et al.27 vorgeschlagen. Was die Schimmelpilze anbelangt, so entstehen diese beim Silieren schon früh im Prozess, wenn noch Sauerstoff im Silo verbleibt. Während der Fermentation hemmt jedoch der mit der Anwesenheit organischer Säuren verbundene Sauerstoffmangel das Wachstum dieser Mikroorganismen29,30, wie in der vorliegenden Studie beobachtet. Dies zeigt die Wirksamkeit von epiphytischem LAB (siehe ergänzende Abbildung S2), das organische Säuren produziert, die für die Senkung des pH-Werts von 26 im Fermentationsprozess verantwortlich sind, und die Bekämpfung unerwünschter Mikroorganismen wie Enterobakterien und Schimmel während der Fermentation. Ein ähnliches Verhalten wurde von Fernandes et al.5 in rehydrierten Mais- und Sorghumkorn-Silagen berichtet, wobei das Vorhandensein von Schimmel beim Öffnen der Versuchssilos nicht nachgewiesen werden konnte.

Wenn Futter und Getreide siliert werden, werden Proteine ​​auf natürliche Weise in Peptide und freie Aminosäuren abgebaut, und die Desaminierung von Aminosäuren kann aufgrund der Wirkung mikrobieller und pflanzlicher Enzyme zu einem Anstieg des NH3-N in der silierten Masse führen10,31, dies erklärt dies Anstiege der NH3-N-Konzentrationen in CG- und SG-Silagen am 60. und 90. Tag der Gärung (Abb. 2). Kung et al.15 schlugen die Einbeziehung von exogener Protease in Maissilage mit hoher Feuchtigkeit vor, um die Proteolyse zu erhöhen, was zuvor im Fermentationsprozess als unerwünscht angesehen wurde28. Der erhebliche Anstieg der NH3-N-Konzentrationen in CG- und SG-Silagen (Abb. 2) bestätigte die Wirksamkeit der in der vorliegenden Studie verwendeten exogenen Protease beim Abbau von Prolaminen, die die Stärkekörnchen umgeben, wodurch die Stärke für Pansenmikroorganismen besser verdaulich wird32. Somit ist die Konzentration von NH3-N ein Parameter, der auf Proteolyse hinweist, was eine mögliche Verbesserung der Stärkeverdaulichkeit impliziert, da sie eine positive lineare Korrelation (P < 0,001) mit der Verdaulichkeit aufweist15,17, was in der vorliegenden Studie bestätigt wurde (siehe). Ergänzende Abbildung S5).

Der geringere TS-Gehalt nach 90 Tagen der Fermentation im Vergleich zu 60 Tagen, mit Ausnahme der 0,3 %-Dosis des Enzyms (siehe ergänzende Abbildung S6), war wahrscheinlich auf die mikrobielle Aktivität während des Fermentationsprozesses zurückzuführen, die auf natürliche Weise eine Verringerung des DM-Gehalts fördert fortschreitende Silierzeit, wie von Carvalho et al.11 und Da Silva et al.3 für CG-Silagen und Santos et al.13 für rehydrierte SG-Silage bestätigt.

Die in unserer Studie beobachtete Menge an solubilisiertem CP weist darauf hin, dass proteolytische Aktivität in CG und SG während der Fermentation auf natürliche Weise auftrat, wie von Hoffman et al.32 und Junges et al.10 berichtet. Diese Aktivität wird jedoch durch die Zugabe von exogener Protease erhöht (Abb. 3), wie von Kung et al.15 in Maiskornsilage mit hoher Feuchtigkeit und von Ferrareto et al.16 in rehydrierten gentechnisch veränderten Silagen beobachtet wurde. Basierend auf den Ergebnissen unserer Studie kann daher bestätigt werden, dass P-Sol ein Parameter ist, der auf die proteolytische Aktivität hinweist, da es die Stärkeverdaulichkeit verbessert und eine positive lineare Korrelation mit der Verdaulichkeit zeigt (siehe ergänzende Abbildung S5), wie Ferrareto et al al.17 und Kung et al.15.

Ein interessantes Ergebnis unserer Studie war die Verringerung der NDF-Konzentrationen am 60. und 90. Tag der Fermentation im Vergleich zum Zeitraum 0 (Null) mit steigenden Dosen des Enzyms in Silagen beider Körner (Abb. 4). Eine mögliche Erklärung für diese Verringerung wäre die Solubilisierung von Zellwandkomponenten durch die Aktivität säuretoleranter Enzyme in den silierten Körnern33, was möglicherweise zum Anstieg der WSC-Konzentration während der Fermentation34 beitrug (siehe ergänzende Abbildung S3). Young et al.28 beobachteten auch eine Verringerung der NDF-Konzentrationen in mit Protease behandelter Ganzmaispflanzensilage als Funktion der Lagerzeit. Proteasen können Strukturproteine ​​in der pflanzlichen Zellwand entfernen, was zu einem schnelleren Zugang von Pansenmikroorganismen zu Zellulose und Hemizellulose führt35, was wahrscheinlich auch zum Anstieg der P-Sol-Konzentrationen der in unserer Studie behandelten Silagen beiträgt. Diese Autoren beobachteten, dass die Zugabe von Protease zur Ration vor dem Füttern der Tiere die NDF-Verdaulichkeit verbesserte.

Proteine, die die Stärkekörner in Körnern umgeben, stellen eine physikalisch-chemische Barriere für amylolytische Mikroorganismen im Pansen dar, die die Verdauung von Stärke einschränkt32. Kung et al.15 hoben die Proteolyse als Hauptmechanismus hervor, um die Verdauung von Pansenstärke in Silagen mit einer Stärkequelle zu steigern, da während der Fermentation eine Solubilisierung der Proteinmatrix stattfindet, was, wie beobachtet, die Kontaktoberfläche für die Wirkung von Pansenmikroorganismen vergrößert in unserer Studie und früheren anderen2,16,32. Die in der vorliegenden Studie beobachtete höchste Enzymdosis zur Bereitstellung einer maximalen Stärkeverdaulichkeit für SG-Silage (Abb. 5) ist wahrscheinlich durch die Tatsache gerechtfertigt, dass das Sorghumkorn im peripheren Endosperm einen höheren Anteil an Proteinen aufweist als im Maiskörner, was zunimmt Widerstand gegen das Eindringen von Wasser, was es widerstandsfähiger gegen enzymatischen Abbau macht36 und somit im Vergleich zu CG sowohl vor als auch nach der Fermentation einen geringeren P-Sol-Wert liefert. Darüber hinaus können ernährungshemmende Faktoren die Darm- und Gesamtverdaulichkeit von Sorghum bei Wiederkäuern verringern37.

Es ist erwähnenswert, dass die Stabilität von Enzymen und ihre Fähigkeit, richtig mit dem Zielsubstrat zu interagieren, ein Faktor sind, der bei der Verwendung dieses Zusatzstoffs in Silage zu inkonsistenten Reaktionen führen kann. Jedes Enzym hat einen optimalen Temperatur- und pH-Bereich und wirkt am effizientesten, wenn die Bedingungen nahezu ideal sind38,39. Daher stützen die Reaktionen, die mit der Verwendung des Enzyms in CG- und SG-Silagen unter den vorliegenden Bedingungen erzielt werden, unsere Hypothese, dass die Zugabe von Protease die Stärkeverdaulichkeit erhöht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Zugabe von 0,30 % exogener Protease zum Zeitpunkt der CG-Silierung und von 0,50 % rehydratisiertem SG die proteolytische Aktivität während der Fermentation begünstigte und zu einer Erhöhung der In-situ-Stärkeverdaulichkeit in kürzerer Lagerzeit führte. Eine praktische Implikation ist, dass Sorghum im Vergleich zu Mais zwar eine interessante Option ist, wenn man bedenkt, dass es sich um den niedrigsten historischen Vermarktungspreis handelt, Sorghum jedoch eine um 66,6 % höhere Dosis als Mais benötigt, um die Stärkeverdaulichkeit nach 60 Tagen Fermentation zu maximieren. Dieser Sachverhalt muss bei der Auswahl der zu rehydrierenden und silierenden Getreidesorte berücksichtigt werden. Es ist jedoch bemerkenswert, dass die CG-Silagen höhere ISSD-Werte aufwiesen als die SG-Silagen. Es müssen Studien durchgeführt werden, um die Leistung von Wiederkäuern, die mit diesen Silagen gefüttert werden, sowie den Kostenvorteil der Zugabe von exogener Protease zum Zeitpunkt der Silierung zu bewerten.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Abteilung für Tierwissenschaften, Bundesuniversität Vicosa, Viçosa, 36570-900, Brasilien

João Paulo Santos Roseira, Odilon Gomes Pereira, Tâmara Chagas da Silveira, Vanessa Paula da Silva, Wagner Sousa Alves, Mariele Cristina Nascimento Agarussi und Karina Guimarães Ribeiro

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JPSR führte das Experiment durch, analysierte und erstellte das Manuskript. OGP hat das Experiment entworfen und zum Verfassen des Manuskripts beigetragen. TCS führte die Analysen der chemischen Zusammensetzung durch. VPS führte die mikrobiologischen Analysen durch. WSA führte die In-situ-Analysen durch. MCNA führte die Stärkeanalysen durch und KGR trug zum Verfassen des Manuskripts bei. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Odilon Gomes Pereira.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Roseira, JPS, Pereira, OG, da Silveira, TC et al. Auswirkungen der Zugabe von exogener Protease auf die Fermentation und den Nährwert von rehydrierten Mais- und Sorghumkorn-Silagen. Sci Rep 13, 7302 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34595-w

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Eingegangen: 08. März 2023

Angenommen: 04. Mai 2023

Veröffentlicht: 05. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34595-w

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